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葉綠素是光合作用中最重要的色素, 與光合性能和籽粒產(chǎn)量密切相關(guān)。關(guān)于作物葉綠素含量的遺傳分析, 在水稻、小麥、大麥、棉花和高粱等作物中都有研究報(bào)道, 主要結(jié)果集中在不同發(fā)育時(shí)期葉綠素含量的QTL 檢測(cè), 也有高葉綠素含量基因的發(fā)掘。但是, 有關(guān)大豆葉綠素含量遺傳分析報(bào)道較少, 目前已檢測(cè)了鐵缺乏黃化的QTL和葉綠素缺乏的兩個(gè)基因座, 有關(guān)不同生育時(shí)期葉綠素含量QTL 檢測(cè)也只有崔世友等的報(bào)道。更重要地, 有關(guān)多環(huán)境條件下不同生育時(shí)期葉綠素含量的遺傳分析很少。為此, 本研究將開(kāi)展不同環(huán)境條件下大豆不同生育時(shí)期葉綠素含量的遺傳研究, 解析其遺傳基礎(chǔ)。

本研究利用已構(gòu)建的溧水中子黃豆×南農(nóng)493-1組合244 株F2 群體150 個(gè)SSR 分子標(biāo)記, 利用SPAD-502 葉綠素儀分別于2007 年和2008 年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站和臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)站測(cè)定了葉綠素含量13 次, 用復(fù)合區(qū)間作圖法分析了葉綠素含量的動(dòng)態(tài)表達(dá), 檢測(cè)到控制葉綠素含量的主效QTL, 并探討不同環(huán)境和不同生長(zhǎng)時(shí)期下, 控制大豆葉綠素含量的QTL 的規(guī)律性, 為大豆高產(chǎn)育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

2005 年夏, 在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站配制溧水中子黃豆(P1)×南農(nóng)493-1(P2)雜種F1, 同年在海南南繁獲得F2 種子。2006 年夏, 在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站種植F2 種子, 獲得244 株F2 群體。小區(qū)行長(zhǎng)3 m, 行距50 cm, 株距10 cm。采用系譜法衍生F2:3和F2:4 家系群體。2007 年夏, 在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站, 按每F2:3家系種植3 行小區(qū), 完全隨機(jī)設(shè)計(jì),小區(qū)行長(zhǎng)2 m, 株距10 cm, 成熟時(shí)中間一行單獨(dú)收獲考種。2008 年夏, 在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站和山東臨沂農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)站, 按2007 年種植F2:3 家系方式種植F2:4 家系群體。

1.2 SSR 遺傳圖譜的構(gòu)建

參照SSR 標(biāo)記“大豆公共遺傳圖譜” 從大豆數(shù)據(jù)庫(kù)SoyBase (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得SSR 引物序列972 對(duì), 由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。篩選出親本和F2 群體間有多態(tài)性的SSR引物150 對(duì)。

采用Saghai-Maroof 等[16]報(bào)道的CTAB 方法提取DNA。PCR 總體積為15 μL, 含模板DNA (20 ngμL–1) 5 μL, 10×PCR buffer [含200 mmol L–1 Tris-HCl(pH 8.4) 、200 mmol L–1 KCl 、100 mmol L–1(NH4)2SO4、15 mmol L–1 Mg2+] 1.5 μL, 10 mmol L–1dNTP 0.2 μL, 5 U μL–1 Taq 酶0.15 μL, 10 pmol 引物3μL, ddH2O 5.15 μL。PCR 程序?yàn)?5℃預(yù)變性2 min;94℃變性30, 退火(不同引物退火溫度介于47~55℃之間) 45℃, 72℃延伸1 min, 35 個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10 min, 4℃保存。用8%非變性聚丙烯酰胺膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離, 銀染檢測(cè)。

采用Joinmap 3.0 軟件包構(gòu)建連鎖圖。用Group 命令, 以LOD 值大于3.0 進(jìn)行人工分組, 每一個(gè)Group 可以采用不同的LOD 值標(biāo)準(zhǔn), 然后選擇Calculate map 命令, 用Kosambi 作圖函數(shù)進(jìn)行重組率與遺傳距離間轉(zhuǎn)換, 參考大豆公共遺傳圖譜整合染色體上標(biāo)記。

1.3 葉綠素含量的測(cè)定

在苗期第7 片復(fù)葉展開(kāi)時(shí), 對(duì)親本及其每個(gè)F2衍生家系的中間行取生長(zhǎng)正常單株的倒3 復(fù)葉功能葉的中間葉片, 每家系固定觀測(cè)5 株, 用日本產(chǎn)SPAD-502 型葉綠素計(jì)數(shù)儀測(cè)定每單株1 片葉的上、中、下3 點(diǎn), 以平均值SPAD 值度量該葉片的葉綠素含量。

2007 年在江浦試驗(yàn)站, 采用每周測(cè)量1 次的方式(24/7、30/7、5/8、11/8、17/8、23/8、29/8 和4/9,日/月), 從苗期到盛花期共測(cè)量8 次(數(shù)據(jù)集I)。2008年在江浦試驗(yàn)站, 只在初花期(8 月8 日)測(cè)1 次(數(shù)據(jù)集II)。2008 年在臨沂農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)站, 從苗期到初花期共測(cè)4 次(14/7、20/7、26/7 和1/8, 日/月)(數(shù)據(jù)集III)。

1.4 QTL 定位方法

利用Win QTL Cartographer v2.5 軟件包的復(fù)合區(qū)間作圖(composite interval mapping, CIM)分析數(shù)據(jù)集I~III, 以向前逐步回歸分析方法選擇協(xié)變量標(biāo)記控制遺傳背景, 其他按標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置。以LOD 值大于2.5 作為QTL 存在的閾值。用MapChart 2.2 將QTL 定位結(jié)果繪制成QTL圖。按照QTL+性狀+連鎖群+數(shù)字命名QTL, 其中QTL 以小寫(xiě)q 開(kāi)頭, 性狀以英文縮寫(xiě)表示, 數(shù)字表示同一性狀在該連鎖群上檢測(cè)到的不同QTL 個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)間葉綠素含量的表型變異特征

從表1 可知, 溧水中子黃豆(P1)不同時(shí)間點(diǎn)葉綠素含量及其平均含量與南農(nóng)493-1 都存在顯著差異;F2:3 和F2:4 家系間也存在遺傳變異, 呈偏態(tài)與非正態(tài)分布, 說(shuō)明存在主效QTL 或QTL 與環(huán)境互作。

2.2 葉綠素含量QTL 的動(dòng)態(tài)表達(dá)

用復(fù)合區(qū)間作圖法分析數(shù)據(jù)集I~III, 檢測(cè)到葉綠素含量共有20 個(gè)QTL, 結(jié)果見(jiàn)表2 和圖1。2007 年江浦試驗(yàn)站的8 次測(cè)量中共檢測(cè)到10個(gè)QTL, 分布在6 個(gè)連鎖群上。第1~8 時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)到3、0、2、2、1、1、1 和0 個(gè)QTL, 其中1~4時(shí)期共檢測(cè)到7 個(gè)QTL, 說(shuō)明葉綠素合成基因在葉綠素合成前期表達(dá)較為活躍, 每個(gè)時(shí)期都有0~3 個(gè)QTL 控制葉綠素的合成; 在5~8 時(shí)期共檢測(cè)到3 個(gè)QTL, 說(shuō)明葉綠素的后期合成相對(duì)要少一些, 這是因?yàn)檫@個(gè)時(shí)期已經(jīng)是大豆的鼓粒期, 葉綠素的合成已達(dá)頂峰, 以后就逐漸分解。8 次檢測(cè)中, N 連鎖群上的satt234~satt022 有3 次被檢測(cè)到, 說(shuō)明該區(qū)間可能存在控制葉綠素合成的基因; D1a 和F 連鎖群上在不同基因座上都檢測(cè)到2 次, 說(shuō)明控制葉綠素合成的位點(diǎn)分布在不同的連鎖群上。從貢獻(xiàn)率上看, 大于10%的QTL 有5 個(gè); qchl-N-1 在8 次測(cè)量中共出現(xiàn)3 次, 有兩次貢獻(xiàn)率較高, 分別達(dá)57%和10%。在2008 年臨沂試驗(yàn)站的4 次測(cè)量中, 共檢測(cè)到6 個(gè)QTL, 分布在6 個(gè)不同的連鎖群上。第1~4 次分別檢測(cè)到2、2、1 和1 個(gè)QTL。各QTL 的位置均不相同。從貢獻(xiàn)率來(lái)看, 大于10%的有2 個(gè); 最大貢獻(xiàn)率14%的QTL 是qchl-D2-2。

在2008 年江浦試驗(yàn)站的1 次測(cè)量中, 共檢測(cè)到4 個(gè)QTL, 分布在4 個(gè)連鎖群上。雖然M 連鎖群satt463 標(biāo)記兩側(cè)都存在QTL, 但是這兩個(gè)QTL 效應(yīng)方向完全一樣, 很可能是一個(gè)QTL, 為此只列出LOD 較大的qchl-M-1。從貢獻(xiàn)率來(lái)看, 大于10%的是qchl-D1a-1, 為30%。

在3 個(gè)數(shù)據(jù)集的QTL 檢測(cè)中, QTL 在N 連鎖群上出現(xiàn)了4 次, 在F、D1a 和M 連鎖群上出現(xiàn)了3次, 在K 連鎖群上出現(xiàn)了2 次, 說(shuō)明這幾個(gè)連鎖群可能是葉綠素合成基因的位置所在。同一地點(diǎn)(江浦)的不同年份間只檢測(cè)到1 個(gè)共同的QTL, 即位于sat_160~satt147 間的qchl-D1a-1。江浦和臨沂兩地點(diǎn)間共同檢測(cè)到1 個(gè)QTL, 位于K 連鎖群上的qchl-K;相連鎖的QTL 有2 個(gè), 分別位于M 和N 連鎖群。從上述結(jié)果看, 不同時(shí)期檢測(cè)到的葉綠素含量QTL 多不相同, 共同QTL 比例較低, 說(shuō)明多數(shù)基因的表達(dá)是分階段的、動(dòng)態(tài)的。但也有的基因表達(dá)是幾個(gè)時(shí)期都進(jìn)行的, 控制葉綠素含量的基因是多條染色體的多個(gè)QTL, 如qchl-N-1。

3 討論

本文的葉綠素含量QTL 定位結(jié)果具有一定的可靠性, 表現(xiàn)在三方面：(1) 在同一地點(diǎn)(江浦)的不同年份(2007 和2008 年)間、江浦和臨沂不同地點(diǎn)間都檢測(cè)到相同的QTL, 如qchl-D1a-1; (2) 與他人的研究結(jié)果相對(duì)一致, 例如, 與崔世友等利用二年一地?cái)?shù)據(jù)定位的葉綠素QTL 相比較, 與D1a、G 和M連鎖群上satt147、satt688 和sat_391– satt150 標(biāo)記連鎖的QTL 是一致的, 與C2、M 和F 連鎖群上的QTL是相近的; Lin 等檢測(cè)的鐵缺乏黃化葉綠素含量QTL 位于N 連鎖群上, 這與本文在2007 年江浦試驗(yàn)站的8 次的檢測(cè)結(jié)果中N連鎖群上satt234–satt022的QTL 出現(xiàn)3 次的結(jié)果一致; (3) 葉綠素含量QTL與大豆光氧化QTL[23]比較, 有約70%的QTL 是連鎖的, 而粒形性狀QTL[24]的比例少得多(表3)。Fanizza 等認(rèn)為SPAD 值能反映葉片實(shí)際葉綠素含量, 類(lèi)似的研究還有較多, 如Ma 等。說(shuō)明本文用SPAD 值反映植株功能葉片葉綠素含量是可行的。目前, 多數(shù)QTL 定位的研究都只局限于植株數(shù)量性狀某一時(shí)間點(diǎn)的表現(xiàn), 無(wú)法掌握不同發(fā)育時(shí)期各QTL 的效應(yīng)大小和基因作用方向。為此, 需要從動(dòng)態(tài)角度探索作物復(fù)雜性狀的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。實(shí)際上, 數(shù)量性狀的遺傳表達(dá)與發(fā)育階段密切相關(guān),存在基因表達(dá)的發(fā)育階段性, 不同發(fā)育階段的性狀變化是基因的選擇性有序表達(dá)的結(jié)果。數(shù)量性狀受特定的微效多基因系統(tǒng)控制, 對(duì)數(shù)量性狀在發(fā)育不同時(shí)段的基因表達(dá)和效應(yīng)進(jìn)行研究, 有助于揭示數(shù)量性狀發(fā)育的分子遺傳機(jī)理, 其研究結(jié)果對(duì)分子

標(biāo)記輔助選擇育種實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。迄今為止, 已在水稻、玉米、小麥和大豆

等作物上, 從動(dòng)態(tài)角度剖析了株高和分蘗等復(fù)雜性狀的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。但是, 針對(duì)葉綠素含量遺傳機(jī)制的動(dòng)態(tài)分析還比較少, 特別是大豆葉綠素含量。從本文結(jié)果看, 不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到的葉綠素含量QTL差異較大, 共同的QTL 不多(N 連鎖群除外)。這與曹樹(shù)青等的結(jié)果相似。筆者認(rèn)為, 植物體內(nèi)的葉綠素不斷地進(jìn)行新陳代謝, 有合成也有降解, 葉綠素的生物合成是比較復(fù)雜的, 同時(shí), 光照、溫度、營(yíng)養(yǎng)元素、氧、水分等也影響葉綠素形成。所以, 控制葉綠素含量的表達(dá)在時(shí)空上應(yīng)該存在差異。這也說(shuō)明葉綠素含量的遺傳機(jī)制是十分復(fù)雜的, 還需要進(jìn)一步剖析。

4 結(jié)論

兩環(huán)境8 個(gè)發(fā)育時(shí)期共檢測(cè)到20 個(gè)與葉綠素含量相關(guān)的QTL, 雖然不同發(fā)育時(shí)期間、年份間和地點(diǎn)間共同的QTL 較少, 但是在N、D1a、F 和K 連鎖群上仍有重復(fù)出現(xiàn)3~4 次的QTL, 如D1a 連鎖群上分子標(biāo)記sat_160 和satt147 間的qchl-D1a-1。