化學(xué)發(fā)光分析方法測(cè)量蛋白質(zhì)含量的優(yōu)勢(shì)及步驟
來(lái)源： http:/// 類別：實(shí)用技術(shù) 更新時(shí)間：2013-03-07 閱讀次
【本資訊由中國(guó)糧油儀器網(wǎng)提供】 目前，蛋白質(zhì)的測(cè)定方法有雙縮脲法、Lowry法、Bradford法、染料結(jié)合分光光度法、液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、自動(dòng)型凱氏定氮儀等�；瘜W(xué)發(fā)光分析方法由于靈敏度高、分析速度快、裝置簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，在食品和環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示出廣泛的應(yīng)用前景。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法用于金屬離子、氨基酸和藥物分析測(cè)定，也有一些用于蛋白質(zhì)檢測(cè)方面的報(bào)道。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)某些蛋白質(zhì)對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀體系發(fā)光反應(yīng)具有很強(qiáng)的增敏特性，并通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)的各種條件，建立了一種測(cè)定蛋白質(zhì)的分析方法。儀器與試劑自行組裝的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光儀，包括IFIS-C型智能流動(dòng)注射進(jìn)樣器和CL流通池；R-212型光電倍增管；ND-802型直流前置放大器；HW-2000色譜工作站；818型酸度計(jì)。魯米諾儲(chǔ)備溶液：2.0×10-2mol•L-1；鐵氰化鉀儲(chǔ)備液：0.05mol•L-1；氫氧化鈉溶液：1.0mol•L-1；卵清白蛋白(OVA)儲(chǔ)備溶液：0.5mg•mL-1；牛血清白蛋白(BSA)儲(chǔ)備溶液：0.5mg•mL-1；溴化十六烷基三甲基胺(CTMAB)標(biāo)準(zhǔn)溶液：1.0×10-2mol•L-1；十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液：5.0×10-2mol•L-1；溴化鉀溶液：2.5mol•L-1；聚乙二醇辛基苯基醚(OP)溶液：2.0×10-2mol•L-1；β-環(huán)糊精(β-CD)溶液：2.0×10-2mol•L-1；三氯甲烷、乙醇、甲醇和乙腈均為體積分?jǐn)?shù)為20%的水溶液。試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。試驗(yàn)方法分析流路見(jiàn)圖1，魯米諾、鐵氰化鉀溶液(A泵)及載流、試樣(B泵)分別由兩蠕動(dòng)泵輸入。從進(jìn)樣閥出來(lái)的試樣在流經(jīng)反應(yīng)器時(shí)與載流在一定程度上相混，兩相反應(yīng)的產(chǎn)物在流經(jīng)流通池時(shí)得到檢測(cè)，信號(hào)由光電倍增管(PMT)放大，然后輸出。
流速的選擇化學(xué)發(fā)光流動(dòng)注射體系中，流速太慢會(huì)導(dǎo)致最大發(fā)光信號(hào)出現(xiàn)在進(jìn)入流通池之前；流速太快會(huì)導(dǎo)致最大發(fā)光信號(hào)出現(xiàn)在進(jìn)入流通池之后，都不能被光電倍增管完全檢測(cè)。選擇載流、試樣的流速為5.0mL•min-1，魯米諾與鐵氰化鉀的流速為4.0mL•min-1。魯米諾濃度的選擇在卵清白蛋白-魯米諾-鐵氰化鉀和牛血清白蛋白-魯米諾-鐵氰化鉀兩體系中，當(dāng)魯米諾的濃度在2.0×10-6~8.0×10-5mol•L-1范圍，隨著濃度的增加，兩體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度也增大，但當(dāng)魯米諾濃度超過(guò)5.0×10-5mol•L-1時(shí)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度均降低。魯米諾濃度為5.0×10-5mol•L-1時(shí)，峰形好，信噪比(S/N=3)最佳。選擇魯米諾濃度為5.0×10-5mol•L-1。鐵氰化鉀濃度的選擇試驗(yàn)結(jié)果表明：鐵氰化鉀濃度為6.0×10-4mol•L-1時(shí)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大；隨后鐵氰化鉀濃度繼續(xù)增大，蛋白質(zhì)發(fā)光體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度反而降低。試劑pH值的選擇試驗(yàn)結(jié)果表明：鐵氰化鉀與魯米諾的酸度對(duì)發(fā)光體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度都有明顯的影響，在pH為12.0和pH為12.2時(shí)，卵清白蛋白和牛血清白蛋白的發(fā)光強(qiáng)度和信噪比(S/N=3)達(dá)到最大。試樣pH值的選擇試驗(yàn)結(jié)果表明：卵清白蛋白和牛血清白蛋白在pH9.0~12.2，pH9.0~12.5范圍內(nèi)，體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度隨著試樣溶液的pH值升高而增大；隨后試樣的pH增大相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度反而降低，而且噪音增大峰形變差。選擇試樣溶液的pH分別為12.2和12.5。增敏劑的選擇試驗(yàn)結(jié)果表明：聚乙二醇辛基苯基醚的加入使反應(yīng)的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度降低；溴化鉀和β-環(huán)糊精能明顯增強(qiáng)魯米諾-鐵氰化鉀體系相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，但對(duì)蛋白質(zhì)-魯米諾-鐵氰化鉀無(wú)協(xié)同增強(qiáng)作用；十二烷基磺酸鈉、三氯甲烷、乙醇、甲醇、乙腈等均未顯示出明顯的協(xié)同催化效果，溴化十六烷基三甲基胺對(duì)該體系的發(fā)光具有明顯增強(qiáng)作用。試驗(yàn)選擇5.0×10-5mol•L-1溴化十六烷基三甲基胺溶液�；瘜W(xué)發(fā)光曲線圖2為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的化學(xué)發(fā)光曲線，試驗(yàn)結(jié)果表明：蛋白質(zhì)對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀發(fā)光體系催化效應(yīng)比較強(qiáng)；體系的反應(yīng)迅速；化學(xué)發(fā)光體系有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。共存物質(zhì)的影響在選定的試驗(yàn)條件下，考察了多種物質(zhì)對(duì)3.0×10-8mol•L-1牛血清白蛋白發(fā)光強(qiáng)度的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明：1000倍的甲醇、乙醇、EDTA、SO2-4、NO-3、F-；100倍的CHCl3、乙腈；50倍的亮氨酸；500倍的丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、天冬酰胺、賴氨酸和谷氨酸；100倍的Fe3+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Al3+；1倍的Cu2+、Pb2+、Mn2+、Cr6+；0.1倍的Ni2+、Co2+；大量的Na+、K+不干擾。Cr3+、OVA干擾嚴(yán)重。加入與金屬離子反應(yīng)比例為1∶1的EDTA可以消除Mn2+以外的大部分金屬離子的干擾，加入100倍的EDTA后可完全消除金屬離子的干擾。線性范圍、檢出限與精密度在選定的試驗(yàn)條件下，牛血清白蛋白和卵清白蛋白分別在1.5×10-10~3.8×10-7mol•L-1、1.8×10-10~2.2×10-7mol•L-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，回歸方程分別為I=3.0×109C+197.53(r=0.9988)和I=1.0×1010C+527.18(r=0.9964)；檢出限(S/N=3)分別為1.5×10-10mol•L-1、1.8×10-10mol•L-1；對(duì)7.6×10-8mol•L-1牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品重復(fù)6次測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.88%。樣品測(cè)定結(jié)果按試驗(yàn)方法對(duì)人體血清(用水稀釋1000倍)中的蛋白質(zhì)總量進(jìn)行測(cè)定。
本方法測(cè)定值Protein foundby thismethodρ/(g•L-1)RSD/%加標(biāo)量Am′t ofstd. addedρ/(g•L-1)回收量Am′trecovered雙縮脲法測(cè)定值Protein foundby the Biuretmethodρ/(g•L-1)1 78.9 1.55 60.0 54.1 78.52 83.8 2.54 10.0 11.3 83.93 74.6 3.71 20.0 21.4 75.84 84.0 2.38 20.0 18.5 81.85 81.2 2.31 40.0 41.8 80.56 83.0 2.64 40.0 36.6 83.8本法測(cè)定蛋白質(zhì)與經(jīng)典的雙縮脲法相比，線性范圍寬、檢出限低、靈敏度高，對(duì)人體血清樣品測(cè)定的結(jié)果表明，本法具有與雙縮脲法相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確度。
流速的選擇化學(xué)發(fā)光流動(dòng)注射體系中，流速太慢會(huì)導(dǎo)致最大發(fā)光信號(hào)出現(xiàn)在進(jìn)入流通池之前；流速太快會(huì)導(dǎo)致最大發(fā)光信號(hào)出現(xiàn)在進(jìn)入流通池之后，都不能被光電倍增管完全檢測(cè)。選擇載流、試樣的流速為5.0mL•min-1，魯米諾與鐵氰化鉀的流速為4.0mL•min-1。魯米諾濃度的選擇在卵清白蛋白-魯米諾-鐵氰化鉀和牛血清白蛋白-魯米諾-鐵氰化鉀兩體系中，當(dāng)魯米諾的濃度在2.0×10-6~8.0×10-5mol•L-1范圍，隨著濃度的增加，兩體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度也增大，但當(dāng)魯米諾濃度超過(guò)5.0×10-5mol•L-1時(shí)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度均降低。魯米諾濃度為5.0×10-5mol•L-1時(shí)，峰形好，信噪比(S/N=3)最佳。選擇魯米諾濃度為5.0×10-5mol•L-1。鐵氰化鉀濃度的選擇試驗(yàn)結(jié)果表明：鐵氰化鉀濃度為6.0×10-4mol•L-1時(shí)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大；隨后鐵氰化鉀濃度繼續(xù)增大，蛋白質(zhì)發(fā)光體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度反而降低。試劑pH值的選擇試驗(yàn)結(jié)果表明：鐵氰化鉀與魯米諾的酸度對(duì)發(fā)光體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度都有明顯的影響，在pH為12.0和pH為12.2時(shí)，卵清白蛋白和牛血清白蛋白的發(fā)光強(qiáng)度和信噪比(S/N=3)達(dá)到最大。試樣pH值的選擇試驗(yàn)結(jié)果表明：卵清白蛋白和牛血清白蛋白在pH9.0~12.2，pH9.0~12.5范圍內(nèi)，體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度隨著試樣溶液的pH值升高而增大；隨后試樣的pH增大相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度反而降低，而且噪音增大峰形變差。選擇試樣溶液的pH分別為12.2和12.5。增敏劑的選擇試驗(yàn)結(jié)果表明：聚乙二醇辛基苯基醚的加入使反應(yīng)的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度降低；溴化鉀和β-環(huán)糊精能明顯增強(qiáng)魯米諾-鐵氰化鉀體系相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，但對(duì)蛋白質(zhì)-魯米諾-鐵氰化鉀無(wú)協(xié)同增強(qiáng)作用；十二烷基磺酸鈉、三氯甲烷、乙醇、甲醇、乙腈等均未顯示出明顯的協(xié)同催化效果，溴化十六烷基三甲基胺對(duì)該體系的發(fā)光具有明顯增強(qiáng)作用。試驗(yàn)選擇5.0×10-5mol•L-1溴化十六烷基三甲基胺溶液�；瘜W(xué)發(fā)光曲線圖2為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的化學(xué)發(fā)光曲線，試驗(yàn)結(jié)果表明：蛋白質(zhì)對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀發(fā)光體系催化效應(yīng)比較強(qiáng)；體系的反應(yīng)迅速；化學(xué)發(fā)光體系有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。共存物質(zhì)的影響在選定的試驗(yàn)條件下，考察了多種物質(zhì)對(duì)3.0×10-8mol•L-1牛血清白蛋白發(fā)光強(qiáng)度的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明：1000倍的甲醇、乙醇、EDTA、SO2-4、NO-3、F-；100倍的CHCl3、乙腈；50倍的亮氨酸；500倍的丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、天冬酰胺、賴氨酸和谷氨酸；100倍的Fe3+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Al3+；1倍的Cu2+、Pb2+、Mn2+、Cr6+；0.1倍的Ni2+、Co2+；大量的Na+、K+不干擾。Cr3+、OVA干擾嚴(yán)重。加入與金屬離子反應(yīng)比例為1∶1的EDTA可以消除Mn2+以外的大部分金屬離子的干擾，加入100倍的EDTA后可完全消除金屬離子的干擾。線性范圍、檢出限與精密度在選定的試驗(yàn)條件下，牛血清白蛋白和卵清白蛋白分別在1.5×10-10~3.8×10-7mol•L-1、1.8×10-10~2.2×10-7mol•L-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，回歸方程分別為I=3.0×109C+197.53(r=0.9988)和I=1.0×1010C+527.18(r=0.9964)；檢出限(S/N=3)分別為1.5×10-10mol•L-1、1.8×10-10mol•L-1；對(duì)7.6×10-8mol•L-1牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品重復(fù)6次測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.88%。樣品測(cè)定結(jié)果按試驗(yàn)方法對(duì)人體血清(用水稀釋1000倍)中的蛋白質(zhì)總量進(jìn)行測(cè)定。
本方法測(cè)定值Protein foundby thismethodρ/(g•L-1)RSD/%加標(biāo)量Am′t ofstd. addedρ/(g•L-1)回收量Am′trecovered雙縮脲法測(cè)定值Protein foundby the Biuretmethodρ/(g•L-1)1 78.9 1.55 60.0 54.1 78.52 83.8 2.54 10.0 11.3 83.93 74.6 3.71 20.0 21.4 75.84 84.0 2.38 20.0 18.5 81.85 81.2 2.31 40.0 41.8 80.56 83.0 2.64 40.0 36.6 83.8本法測(cè)定蛋白質(zhì)與經(jīng)典的雙縮脲法相比，線性范圍寬、檢出限低、靈敏度高，對(duì)人體血清樣品測(cè)定的結(jié)果表明，本法具有與雙縮脲法相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確度。
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